HPLC分離測(cè)定*及其降解產(chǎn)物

摘　要：

目的：建立新的HPLC分離測(cè)定*及其降解產(chǎn)物的方法。方法：色譜條件為：Nova-Pak C18色譜柱；0.02mol.L-1*溶液（pH4.5）-乙腈（95∶5）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為230 nm。

結(jié)果：在0.24～1.20mg.ml-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9991，平均回收率為100.6%（n=5），RSD＝0.47%，重復(fù)進(jìn)樣RSD＝0.06%（n=5），*及其降解產(chǎn)物得到基線分離。

結(jié)論：本法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于*的含量測(cè)定及其降解產(chǎn)物的檢查。



　　*（氨芐*）為β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)革蘭陽性、陰性菌有較強(qiáng)的抑制作用，臨床應(yīng)用較廣。中國藥典1995年版二部、美國藥典ⅩⅩⅢ版、英國藥典1993年版均有收載，其質(zhì)量控制方法相應(yīng)為硫醇汞鹽紫外分光光度法，HPLC，電位滴定法。分光法、電位法，操作繁瑣，分析周期長，專屬性不夠好，且汞鹽毒性較大。本文采用HPLC分離測(cè)定了*及其降解產(chǎn)物，結(jié)果滿意。

1　儀器與試藥

　　日本島津LC-6A/液相色譜儀/，SPD-6N紫外-可見檢測(cè)器，C-R4A色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)。
氨芐*三水物（*）對(duì)照品（批號(hào)410-9402，含量85.6%，中國藥品生物制品檢定所）；注射用*鈉（批號(hào)961210，961248，970302，石家莊市第二制藥廠）；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為重蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

　　色譜柱：大連化學(xué)物理研究所Nova-Pak C18（4.6 mm×200 mm,4 μm）；流動(dòng)相：0.02mol。L-1*溶液（pH4.5）-乙腈（95∶5），薄膜（0.5 μm）過濾并脫氣；檢測(cè)波長為230 nm；流速：1.3ml。min-1；靈敏度：0.08 AUFS；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2　系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

　　堿性降解產(chǎn)物的制備：稱取*對(duì)照品，用0.01 mol。L-1氫氧化鈉溶液制成0.6 mg。ml-1溶液，放置30min，然后用磷酸調(diào)節(jié)溶液pH值至（4.5±0.1），量取5 ml置25 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。
取上述溶液20 μl注入色譜儀，在上述色譜條件/下分離，得色譜圖（圖1），從圖中可見，*峰的保留時(shí)間約為12min，*與降解產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)基線分離。理論塔板數(shù)以*峰計(jì)為2700，*峰與相鄰降解產(chǎn)物峰的分離度為7。

2.3　線性關(guān)系

　　精密稱取*對(duì)照品適量，用流動(dòng)相制成2.4 mg。ml-1溶液，精密量取1，2，3，4，5 ml分別置10ml量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻。在上述色譜條件下各進(jìn)樣20 μl測(cè)定。結(jié)果*在0.24～1.20mg。ml-1的濃度范圍內(nèi)峰面積（A）與濃度（c,mg。ml-1）線性關(guān)系良好，回收方程為：A=201690c+5050,r=0.9991。

2.4　精密度試驗(yàn)

　　取*對(duì)照品，用流動(dòng)相制成0.6mg。ml-1溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，峰面積的RSD為0.06%，精密度良好。




2.5　重現(xiàn)性試驗(yàn)

　　精密稱取同一批號(hào)樣品5份，按樣品測(cè)定方法操作。結(jié)果RSD為0.40%。

2.6　回收率試驗(yàn)

　　精密稱取已準(zhǔn)確測(cè)定含量的注射用*鈉，準(zhǔn)確加入適量*對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解，按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見表1。
表1　回收率測(cè)定結(jié)果.n=5


加入量/mg 測(cè)定量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%
11.81 11.93 101.00
11.95 12.01 100.50 100.60 0.47
12.01 11.99 　99.80
12.12 12.19 100.60
12.24 12.35 100.90

2.7　樣品測(cè)定
　　精密稱取注射用*鈉樣品3批各適量，分別用流動(dòng)相稀釋成0.6mg。ml-1溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。另精密稱取*對(duì)照品適量，同法稀釋測(cè)定。以外標(biāo)法計(jì)算含量，面積歸一化法檢查降解產(chǎn)物，結(jié)果見表2。

表2　樣品測(cè)定結(jié)果.n=3


批號(hào) 含量/% RSD/% 降解產(chǎn)物/%
961210 86.97 0.18 0.79
961248 86.28 0.15 0.84
970302 87.09 0.11 0.77

3　討　論
3.1　考察了流動(dòng)相中乙腈量對(duì)*保留時(shí)間的影響。乙腈量減少，保留時(shí)間延長，以5%配比，保留時(shí)間較合適。
3.2　考察了流動(dòng)相中，磷酸鹽緩沖液不同的pH值（5.0，4.5，4.0）對(duì)保留時(shí)間的影響。緩沖液的pH值調(diào)至4.5與5.0時(shí)，保留時(shí)間大致相同。pH值調(diào)至4.0時(shí)，保留時(shí)間明顯延長。
3.3　配好的樣品溶液在室溫放置5 h后再測(cè)定，結(jié)果幾乎不變，溶液穩(wěn)定性良好。
3.4　取*對(duì)照品用流動(dòng)相制成95.7 μg。ml-1溶液，于島津UV-265FW型紫外分光光度計(jì)在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描，在波長208 nm處有zui大吸收，但此處為末端吸收，干擾較大。選擇230nm波長處測(cè)定，靈敏度適中，干擾小。
3.5　由于定量管進(jìn)樣的廣泛采用和儀器性能的不斷提高，HPLC精度很高，目前新藥標(biāo)準(zhǔn)中普遍采用外標(biāo)法定量，本實(shí)驗(yàn)的精密度試驗(yàn)很好，因此以外標(biāo)法計(jì)算含量。
3.6　*在堿性條件下遇濕不穩(wěn)定，樣品中存在部分降解產(chǎn)物。本文所述的色譜條件，可使*及其降產(chǎn)物得到基線分離，方法專屬性較高。本法簡便、快速、準(zhǔn)確，適合控制*的質(zhì)量．